細(xì)胞培養(yǎng)中的污染（圖）

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染情況總結(jié)如下:

常見的污染如下：

1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間足夠，壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理

2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長，但時間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個小時，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作

3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染，G內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中**常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。

4、黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。

5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

6、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時就會影響到細(xì)胞的生長，**終形成惡性循環(huán)。

污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等

關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基**培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長就是操作的問題。也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細(xì)胞某項指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結(jié)果。

1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒或者紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水。

2、超凈臺、取材、器材、培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶、操作等因素。

3、超凈臺的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染。

4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進(jìn)入操作。

關(guān)于黑膠蟲：根據(jù)平時的操作，我覺得“黑膠蟲”有沒有可能是以下操作細(xì)節(jié)方面的問題導(dǎo)致的呢？

1、有時候血清瓶或者培養(yǎng)瓶上用標(biāo)記筆寫的字沒有擦掉就直接泡酸，字跡溶解后沉積在酸缸中浸泡的瓶子里沖洗不凈。

2、過火的時候不小心碰到酒精燈的燈芯，粉塵飛進(jìn)培養(yǎng)液內(nèi)。

3、有的同學(xué)習(xí)慣將移液管塞棉花的一端在酒精燈上焚燒一下，灰燼飛進(jìn)培養(yǎng)液內(nèi)。

我的細(xì)胞污染探索。某天打開孵箱，看到我的L1210的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)液又是黃黃的，覺得很不錯，今天又可以傳代了，可是在鏡下一看，細(xì)胞雖然明顯增加了，但并沒有象以前那樣長滿，而且更讓我心驚的是怎么出現(xiàn)了許多黑色的小點，桿狀，而且好像在動來動去，翻轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)，在細(xì)胞很多的地方小點就少，而在細(xì)胞較少的地方小點就多，細(xì)胞的活力也沒有以前好了，**反應(yīng)細(xì)菌污染，請實驗室老師過來看，說不是細(xì)菌污染，這個點要比細(xì)菌的小黑點大的多，也好象不是霉菌，沒有菌絲，沒有常見的團(tuán)壯的生長，肯定不對勁，但到底是什么，說不上來。**后，決定換液、洗滌、離心，換瓶，操作結(jié)束后鏡下看黑點幾乎看不到了，有點放下心來。隔天后去看，培養(yǎng)液還和上面的一樣，但鏡下，那種東西又出來了，在細(xì)胞少的地方，幾乎呈現(xiàn)出粗砂粒樣，我欲哭無淚，知道可能不行了，郁悶的換液后，回家上網(wǎng)·搜，一個名詞跳了出來：黑膠蟲。黑色、桿狀、運(yùn)動、細(xì)胞不會很快死亡，這些描述簡直驚人的一致，我確定了，我受到了黑膠蟲的襲擊。但黑膠蟲是什么，由于網(wǎng)上說法不一，我決定探究一下。shou先，培養(yǎng)液略黃，稍有渾濁，鏡下觀察，細(xì)胞還沒有死，但是已經(jīng)不長了，那種東西已經(jīng)是鋪天蓋地了，滿眼望去，盡是粗砂粒樣，細(xì)胞好像成了一個個汪洋中的小島。細(xì)胞涂片，送到化驗室，革蘭氏染色，不久電話回報懷疑－－真菌。**反應(yīng)不可能，親自去了化驗室，看到了片上一個個瓜子樣的小點，染色呈黑色?？次疫€有些懷疑，化驗室的同事又作了滴片，鏡下暗視野40倍可見一個個亮白色芝麻樣的東西在游來游去，再次涂片染色仍和以前一樣，并且可以見到芽孢樣的形狀，他們確定無疑是真菌，但不是常見的念珠軍、霉菌，具體是什么，也說不上來。由于已經(jīng)蓋棺定論，計劃的HE染色、支原體沒有進(jìn)行。已經(jīng)將污染的細(xì)胞扔掉了。休整幾天。附照片。