1、環(huán)境要清潔，進(jìn)行無菌操作前半小時(shí)，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動(dòng)，防止塵埃飛揚(yáng)。治療室應(yīng)每天用紫外線消毒一次。
2、進(jìn)行無菌操作時(shí)，衣帽穿戴要整潔。帽子要把全部頭發(fā)遮蓋，口罩須遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。
3、無菌物品與非無菌物品應(yīng)分別放置。無菌物品不可暴露在空氣中，必須放于無菌包或無菌容器內(nèi)，無菌物品一經(jīng)使用后，必須再經(jīng)滅菌處理后方可使用。從無菌容器中取出的無菌物品，雖未使用，也不可放回?zé)o菌容器內(nèi)。
4、無菌包應(yīng)注明物品的名稱、消毒滅菌日期，并按日期先后順序排放，以便取用，放在固定的地方。無菌包在未污染的情況下，可保存7-14天，過期應(yīng)重新滅菌。 5、取無菌物品時(shí)，必須用無菌持物鉗（鑷）。未經(jīng)消毒的用物不可觸及無菌物或跨越無菌區(qū)。
6、進(jìn)行無菌操作時(shí)，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，應(yīng)更換或重新滅菌。
7、一份無菌物品，只能供一個(gè)病員使用，以免發(fā)生交叉感染。 無菌操作注意事項(xiàng)：
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及
無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟
無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每 次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間 污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間 隔應(yīng)讓
無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦 拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操 作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用， 盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病
毒
感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(**少Class II)。操作過程 中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測下列項(xiàng)目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水 植物外植體消毒和接種：
用于進(jìn)行組織培養(yǎng)的組織、器官和細(xì)胞稱為外植體。在組織培養(yǎng)中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進(jìn)行表面消毒，這是取得培養(yǎng)成功的**基本的和重要的前提。常用消毒劑對(duì)外植體進(jìn)行消毒。從室外取的材料，一般先用自來水沖洗數(shù)分鐘，對(duì)表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，自來水沖洗的時(shí)間要長，幾個(gè)小時(shí)或過夜，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時(shí)用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無菌水洗滌3～5 遍，**后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達(dá)到消毒目的，又不能損傷植物組織和細(xì)胞，還要符合就地取材的原則。對(duì)一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行表面消毒時(shí)，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，shou先用75％乙醇浸泡外植體數(shù)秒鐘**30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無菌水洗滌。有時(shí)在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無菌水洗，進(jìn)一步剝?nèi)讓咏M織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。
用消毒劑對(duì)接種材料進(jìn)行滅菌處理時(shí)，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤外植體整個(gè)組織，促進(jìn)滅菌液充分接觸表面組織，達(dá)到較好的消毒效果。有時(shí)還可以用磁力攪拌、超聲振動(dòng)等方法使消毒殺菌劑進(jìn)入外植體。消毒溶液對(duì)外植體消毒是在
超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養(yǎng)基中。
植物外植體消毒和接種(以胡蘿卜為例)：
1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭
超凈工作臺(tái)臺(tái)面，將培養(yǎng)基及用具放入工作臺(tái)，開
超凈工作臺(tái)紫外燈照射**少20 min，然后開送風(fēng)開關(guān)，之后關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10 min后，再開日光燈進(jìn)行無菌操作。
2 ．將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無菌水洗滌3 次，無菌紙吸干水分。取出培養(yǎng)皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。#p#分頁標(biāo)題#e#3 ．將培養(yǎng)容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養(yǎng)容器放在左手中。將塞蓋用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動(dòng)，以便接種時(shí)拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口（靠手腕的動(dòng)作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過的接種針（環(huán)）觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環(huán)）抽出試管，打開培養(yǎng)容器蓋，將外植體放在培養(yǎng)基上，每瓶放3 塊。封口，貼標(biāo)簽，注明姓名，標(biāo)明時(shí)間和材料名稱。整理好接種室（箱）的臺(tái)面，搞好清潔衛(wèi)生。
4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中，在超凈工作臺(tái)上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用無菌水洗滌3 次，將葉片切成長1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。
5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養(yǎng)基上。
無菌操作原則：
一、在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。
二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。 [無菌操作間]
無菌操作間
四、進(jìn)行無菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。
六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。
七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布?jí)K等，不可裝得過滿，以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。
原則及注意事項(xiàng)
無菌操作原則：
一、在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。 二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無菌物品必須使用無菌持物鉗。
無菌操作間
四、進(jìn)行無菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為**無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。 六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。 七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內(nèi)敷料如干棉球、紗布?jí)K等，不可裝得過滿，以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。
無菌操作技術(shù)及注意事項(xiàng)
1、玻璃器皿的消毒和清潔 ⑴新購玻璃器皿的處理新購玻璃器皿應(yīng)用熱肥皂水洗刷，流水沖洗，再用1%～2%鹽酸溶液浸泡，以除去游離堿，再用水沖洗。對(duì)容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等，經(jīng)清水洗凈后應(yīng)注入濃鹽酸少許，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)，使鹽酸布滿容器內(nèi)壁數(shù)分鐘后傾出鹽酸，再用水沖洗。 ⑵污染玻璃器皿的處理 ①一般試管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分鐘，或在3%～5%漂白粉澄清液內(nèi)4小時(shí)，有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產(chǎn)生泡沫，然后用清水沖洗**無肥皂為止。**后用少量蒸餾水沖洗。 ②細(xì)菌培養(yǎng)用的試管和培養(yǎng)皿可先行集中，用1kg/cm2高壓滅菌15～30分鐘，再用熱水洗滌后，用肥皂洗刷，流水沖洗。 ③吸管使用后應(yīng)集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時(shí)，逐支用流水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗。 ④油蠟沾污的器皿，應(yīng)單獨(dú)滅菌洗滌，先將沾有油污的物質(zhì)棄去，倒置于吸水紙上，100℃烘干半小時(shí)，再用堿水煮沸，肥皂洗滌，流水沖洗。必要時(shí)可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水沖洗，后用清潔或稀鹽酸洗脫染料，再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性，所以不宜用肥皂的堿水洗滌。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水沖洗，再用肥皂或弱堿性煮沸，自然冷卻后，流水沖洗。被結(jié)核桿菌污染或不易洗凈的玻片，可置于清潔液內(nèi)浸泡后再?zèng)_洗。 2、無菌器材和液體的準(zhǔn)備將玻璃器具中的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后，用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，裝入干凈的鋁盒或鐵盒中，于120℃的干燥箱中干燥滅菌2小時(shí)，取出備用。對(duì)于手術(shù)器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，則采用高壓蒸氣滅菌法，即在15磅的條件下，加熱20分鐘。而對(duì)于MEM培養(yǎng)液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負(fù)壓抽濾后使用。 3、無菌操作過程在無菌操作過程中，**重要的是要保持工作區(qū)的無菌、清潔。因此，在操作前20～30分鐘要先啟動(dòng)
超凈臺(tái)和紫外燈，并認(rèn)真洗手和消毒。在操作時(shí)，嚴(yán)禁喧嘩，嚴(yán)禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養(yǎng)瓶應(yīng)在
超凈臺(tái)內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。對(duì)于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處，戴上膠皮乳頭，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。 4、常用清潔液的配制法⑴重鉻酸鉀清潔液：可根據(jù)不同需要，選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中，再慢慢加入濃硫酸。注意，此#p#分頁標(biāo)題#e#
時(shí)可產(chǎn)生高熱，應(yīng)防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強(qiáng)，腐蝕性大，應(yīng)避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質(zhì)，此液應(yīng)貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差，可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸，還可繼續(xù)使用。直到液體變藍(lán)綠色，即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時(shí)，宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿時(shí)，應(yīng)特別注意防止產(chǎn)生高熱而破裂，切忌用量筒來配制。 ⑵磷酸三鈉將其配成5%～10%水溶液，可用于洗滌玻璃器皿上的油污，但經(jīng)常使用腐蝕玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 ⑶硝酸清潔液將其配成50%水溶液，可用于清潔微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二鈉（EDTA鈉鹽）將其配成5%～10%水溶液，可洗脫粘附于玻璃器皿內(nèi)壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌粘附有血液血清等蛋白質(zhì)的吸管、試管等。
無菌操作法
2007-10-24 17:23 【大 中 小】【我要糾錯(cuò)】 無菌操作法，是整個(gè)過程控制在無菌條件下進(jìn)行的一種操作方法。某些藥品加熱滅菌后發(fā)生變質(zhì)、變色或降低含量者可采用無菌操作法制備。此種無菌操作，不僅用于注射劑而且對(duì)其它的如滴眼劑、海棉劑等用于粘膜和創(chuàng)傷的制劑也均適用。無菌操作室或無菌操作所用的一切用具、材料以及環(huán)境，均須應(yīng)用面所述滅菌法滅菌，操作須在無菌操作室或無操作柜內(nèi)進(jìn)行。
（一）無菌操作的空氣滅菌可應(yīng)用上節(jié)《氣體滅菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具體用法不再贅述。藥廠大型無菌操作，常用甲醛溶液加熱熏蒸進(jìn)行空氣滅菌。將甲醛溶液放入瓶內(nèi)，逐漸被吸收蒸氣夾層加熱鍋中，甲醛溶液被加熱，甲醛蒸氣經(jīng)氣出口送入總進(jìn)風(fēng)道，由鼓風(fēng)機(jī)吹入無菌操作室，連續(xù)3小時(shí)后，一般即可將鼓風(fēng)機(jī)關(guān)閉。室溫應(yīng)保持25℃以上，以免室溫過低甲醛蒸氯了聚合而附著于冷表面，濕度應(yīng)保持60％以上，密閉熏蒸12－24小時(shí)以后，再將25％氨水加熱（每m3用8－10ml），從總風(fēng)道送入氨氣約15分鐘，以吸收甲醛蒸氣，然后開啟總出口排風(fēng)，并通入經(jīng)處理過的無菌空氣直到室內(nèi)無臭氣為止。 除用上述方法定期進(jìn)行較徹底的滅菌外，還要對(duì)室內(nèi)的空間、用具（桌椅等）、地面、墻壁等，用3％酚溶液、2％煤酚皂溶液、0.2%新潔而或75％酒精噴灑或擦試。其它用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前開啟外線一小時(shí)，中午休息時(shí)間也要開1／2－1小時(shí)。
（二）無菌操作操作人員進(jìn)入操作之前要洗澡并換上已經(jīng)滅菌的工作服和清潔的鞋子，不使頭發(fā)、內(nèi)衣等露出來，以免造成污染機(jī)會(huì)。安瓿要150－180℃2－3小時(shí)干熱滅菌。橡皮塞要以121℃1小時(shí)熱壓滅菌。有關(guān)器具、機(jī)器都要經(jīng)過滅菌。用無菌操作法制備的注射劑， 大多要加入抑制。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理 小量無菌制劑的制備，也可在無菌操作柜中進(jìn)行。無菌操作柜分小型無菌操作與聯(lián)合無菌無操作兩種小型無菌操作柜又稱單人無菌柜。式樣有單面式與雙面式兩種。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下裝木板，挖二圓孔，孔內(nèi)密接橡皮手套或袖套。藥品及用具等，由側(cè)門送入柜內(nèi)后關(guān)閉。操作時(shí)可完全與外界空氣隔jue。柜內(nèi)空氣的滅菌，可在柜中央上方裝一小型紫外線燈，使用前1小時(shí)啟燈滅菌，或用藥液（如3％酚溶液）噴霧滅菌。聯(lián)合無菌操作柜是由幾個(gè)小型操作柜聯(lián)合制成，以使原料的精制，傳遞分裝及成品暫時(shí)存放等工作全部在柜內(nèi)進(jìn)行。近年來，采用層流
潔凈工作臺(tái)作無菌操作，使用方便，效果可靠。
意義
無菌是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。在微生物實(shí)驗(yàn)中， 操作的目的在于防止待接種細(xì)菌被雜菌污染。只有在培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器皿等處于無菌的前提下，才能保證菌種不被污染。 接種細(xì)菌時(shí)，應(yīng)注意以下幾項(xiàng)：
（1）在超凈工作臺(tái)上操作，工作臺(tái)在使用前要紫外消毒，酒精消毒等 （2）應(yīng)在酒精燈火焰前操作
（3) 取菌種前灼燒接種針或接種環(huán)（要燒紅）
（4）燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種 （5）接種后應(yīng)盡快塞上棉塞
總之，一句話，盡可能防止雜菌污染！?。?！
