無菌（fungus)操作臺標準操作規(guī)程

1.目的：
建立無菌檢查的標準操作規(guī)程，確保檢驗結果的準確性。   
2.范圍：
適用于本廠質監(jiān)科化驗室對本廠生產(chǎn)的注射劑進行無菌檢查。超凈工作臺與生物安全柜（Biosafety Cabinet）不同。超凈工作臺只能保護在工作臺內操作的試劑等不受污染，并不保護工作人員，而生物安全柜是負壓系統(tǒng)，能有效保護工作人員。

3.責任：
化驗員有責任按本操作規(guī)程操作，并對檢驗結果負責。

4.定義：
無菌檢查法系指檢查藥品是否無菌的一種方法。

5.內容：
5.1無菌操作設備：
無菌操作室或超凈工作臺，無菌衣、口罩、帽子、消毒(disinfection)鞋、酒精燈(Alcohol lamp)等。
5.1.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內應有洗手盆、干手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部（part)潔凈度100級超凈工作(gōng zuò)臺。緩沖間及操作室內均設置能達到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作臺應保持空氣正壓。
5.1.2無菌室應每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作臺及可能污染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作臺面，用紫外光燈殺菌半小時。
5.1.3無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理(chǔ lǐ)后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)。取直徑90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板：在35-37℃預培養(yǎng)48小時，證明無菌后將3個平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區(qū)域左、中、右各放1個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將蓋蓋好，置35-37℃培養(yǎng)48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數(shù)相加總數(shù)不得超過10個。
無菌操作臺面或超凈工作臺應定期請有關部門檢測其潔凈度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數(shù)儀），檢測塵埃粒徑≤5μm的粒數(shù)不得超過3.5個／升；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s；細菌菌落數(shù)平均<1個，可根據(jù)無菌狀況定期置換過濾器。
5.1.4無菌室內應準備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉及拖鞋等。
5.2儀器、用具：
5.2.1真空泵、恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、托盤天平（精度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、   三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求規(guī)格）、試管、雙碟（9cm）、注射針、鑷子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環(huán)、微孔濾膜（直徑約5cm），孔徑(aperture)應在0.45±0.02μm )載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。
5.2.2用具的包扎：
5.2.2.1移液管
在移液管上端管內,松松地塞進少許原棉,然后放入不銹鋼滅菌筒內。超凈工作臺是為了適應現(xiàn)代化工業(yè)、光電產(chǎn)業(yè)、生物制藥以及科研試驗等*域對局部工作區(qū)域潔凈度的需求而設計的。
5.2.2.2試管
在管口塞上紗布棉塞。
5.2.2.3無菌衣、褲、帽、口罩
將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入布袋，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。
5.2.2.4注射器
洗滌干凈的注射器及注射針頭裝配好后，放入墊有紗布的帶蓋容器內（飯盒）一層層放好，上面蓋上紗布，然后蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。
5.2.2.5濾器
將檢驗合格后微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出后固定在細菌過濾器的濾板(Filter plate)上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包扎，裝妥后放入容器內，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包扎。
5.2.3用具的滅菌：
將包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌柜中滅菌30分鐘，物品取出時切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓，易致染菌，應置溫箱或或加溫烘干。
5.3培養(yǎng)基、試劑：
5.3.1一般采用商品干燥培養(yǎng)基，臨用時按照使用說明書進行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌使用。
使用前，按要求分裝滅菌好的細菌培養(yǎng)基須經(jīng)30-35℃培養(yǎng)48小時，真菌培養(yǎng)基須經(jīng)20-25℃培養(yǎng)72小時，證明無菌生長后方可使用。
制備的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基應半個月內用完，在供試品接種前，培養(yǎng)基指示劑氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度約1/5，否則須經(jīng)水浴煮沸加熱，只限加熱一次。
5.3.2革蘭氏碘液：
先用3-5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解后，加蒸餾水稀釋**300ml，搖勻。置密閉棕色瓶中備用。
5.3.3結晶紫染色液：
將結紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，與80ml1%草酸銨溶液相混合，靜置48小時使用。超凈工作臺與生物安全柜（Biosafety Cabinet）不同。超凈工作臺只能保護在工作臺內操作的試劑等不受污染，并不保護工作人員，而生物安全柜是負壓系統(tǒng)，能有效保護工作人員。此液穩(wěn)定，置密閉的棕色瓶中可儲存數(shù)月。
5.3.4沙黃染色液：
將0.2g沙黃溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸餾水**100ml。
5.3.5生理鹽水：
稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝后于121±0.5℃濕熱滅菌30分鐘。供作稀釋劑用。
5.3.6 75%乙醇
量取無水乙醇75ml,加水稀釋**100ml，搖勻，即得。
5.3.7 0.1%新潔爾滅：
量取5%新潔爾滅20ml，加水稀釋**約1000ml，搖勻，即得。
5.4培養(yǎng)基靈敏度檢查：
5.4.1新購的干燥培養(yǎng)基或采用不同牌號原材料的新鮮培養(yǎng)基，其質量均應符合靈敏度檢查要求。
   
　　(1)取藤黃微球菌（fungus)[Micrococcus luteus  CMCC（B）  28001］的營養(yǎng)瓊脂斜面和白色念珠菌[Candida  albicans  CMCC（F）98001］的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；取生孢梭菌[Clostridium  sporogenes  CMCC（B）64941]不含瓊脂的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，用滅菌毛細管將其吸**滅菌離心管內，離心，棄去上清液，沉淀菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻菌懸液。然后以10倍系列稀釋后，制成1ml中含10-100個菌并計數(shù)。
    
　　(2)取藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，白色念珠菌的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，取接種**霉菌培養(yǎng)基內，20-25℃用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，制成1ml中含10-100個菌并計數(shù)。
   將藤黃微球菌（fungus)的上述
　　(1)或
　　(2)的稀釋液各1ml，分別接種**每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，生孢梭菌的上述
　　(1)或
　　(2)的稀釋液各1ml，分別接種**每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，白色念珠菌的上述
　　(1)或
　　(2)的稀釋液各1ml，接種**每管裝量為9ml的真菌培養(yǎng)基3管，以未接種的培養(yǎng)基作對照，按規(guī)定(guī dìng)的溫度培養(yǎng)5天并逐日記錄結果。
結果判定：以每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長(Grow)，即該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合要求。
5.4.2配制的培養(yǎng)基應在涼暗處保存，一般不得超過2周，臨用前細菌和霉菌（mold）培養(yǎng)基分別經(jīng)30-35℃和20-25℃培養(yǎng)不少于48小時和72小時，證明無菌生長后方可使用。
5.4.3需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基在試管中裝量高度不得少于7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。
無菌試驗培養(yǎng)時間結束時，指示劑氧化層應不超過培養(yǎng)基深度的1／2。
5.5對照用菌液的制備：
5.5.1試驗用菌種、菌種的復蘇、菌種的接種與保存等均應按照“抗生素微生物檢定法”標準操作規(guī)程項下操作。
5.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus  CMCC（B）26003]的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種**營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，在30-35℃培養(yǎng)16-18小時后，用滅菌生理鹽水稀釋成
　　1:106
5.5.3生孢梭菌菌液用接種環(huán)取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種**相同培養(yǎng)基內，在30-35℃培養(yǎng)18-24小時后，用滅菌生理鹽水稀釋成
　　1:106。
5.5.4白色念珠菌菌液用接種環(huán)取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種**真菌培養(yǎng)基內，在20-25℃培養(yǎng)24小時后，用滅菌生理鹽水稀釋成
　　1:105。
5.5.5上述制備的菌液，一般當日使用。
5.6進入無菌室的操作控制要點：
5.6.1根據(jù)試驗程序,將用具物品搬入緩沖間,打開紫外光燈和空氣(Basin air)過濾裝置并使其工作1小時以上。
5.6.2操作人員用肥皂水刷洗雙手,關閉緩沖間紫外光燈,進入緩沖間內,關閉**層門,用2%來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手,用消毒毛巾擦干,換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。
5.6.3關閉無菌室內紫外光燈，進入第二層門并將用具搬**無菌室內，關閉無菌室門。
5.6.4凡進入無菌室后不應再外出取物品，因此，在每次試驗中所用物品必須計劃好，并準備好備用物品。從進入**層門直**無菌室內，隨操作人員的進入應噴霧2%來蘇爾或0.1 %新潔爾滅溶液。
5.7檢查法：
5.7.1無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用于非抗菌作用的供試品；后者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。
5.7.2操作時，應先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面后，以無菌(意思：沒有活菌)的方法取內容物。
5.7.3凡無菌檢查中，均應取相應溶劑和稀釋劑同法操作控制，作陰性對照。
5.7.4供試品制備：
   用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，蓋為橡皮塞時，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取藥液。按規(guī)定(guī dìng)須稀釋或滅活的供試品，可直接或將瓶內供試液抽出**滅菌玻璃容器內進行滅活處理并稀釋**規(guī)定的體積（volume)和濃度；抽取瓶中內容液體時，應將供試品倒置并使針頭在液面下。
5.7.5直接接種法：
按規(guī)定量取供試品，以無菌(意思：沒有活菌)操作將該供試品分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌液1ml，作陽性對照，另接種于真菌培養(yǎng)基5管。輕輕搖動，使供試品與培養(yǎng)基混合。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置30-35℃、真菌培養(yǎng)基管置20-25℃培養(yǎng)7日。在培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照管在24小時內應有菌生長，如在加入(jiā rù)供試品后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)7天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種**同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)2日，真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。
5.7.6薄膜過濾法：
將微孔濾膜過濾裝置(Apparatus)、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。
取規(guī)定量供試品，按規(guī)定的方法處理后，加入(jiā rù)0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合后，通過裝有孔徑不大于0.45μm的薄膜過濾器，減壓抽干后，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次**少100ml，取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養(yǎng)基中，按規(guī)定溫度和時間培養(yǎng)。陽性對照管應根據(jù)供試品特性加入相應對照菌液1ml（抗細菌藥物(drug)，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌藥物，以白色念珠菌為對照菌）。陽性對照管細菌應在培養(yǎng)24-48小時，真菌應在培養(yǎng)24-72小時有菌生長(Grow)。
5.8結果判斷：
當陽性對照管顯渾濁并確有菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據(jù)觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖渾濁但經(jīng)證明(zhèng míng)并非有菌生長，均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。

6培訓
6.1培訓（作用:知識傳遞、技能傳遞、標準傳遞)對象：化驗員。
6.2培訓時間：二小時。

7記錄
     記錄(jì lù)名稱               保存部門               保存時間
   無菌檢驗記錄              質監(jiān)科            藥品有效期后一年

QF-01-007-00
無菌(意思：沒有活菌)檢驗記錄
品   名：                      批   號：                                                   
規(guī)   格：                      檢驗日期：        年     月     日
培養(yǎng)基名稱
需氣、厭氣菌培養(yǎng)基
真菌培養(yǎng)基
培
養(yǎng)
培養(yǎng)溫度
30―35℃
20―25℃
培養(yǎng)時間


管   號
1
2
3
4
5

1
2
3
4
5

培養(yǎng)天數(shù)及結果(result)
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結  論

備  注

 復核人：                               檢驗人：